Flowcytometrisk DNA-analyse

Flowcytometrisk DNA-analyse er en undersøgelsesmetode, der kan undersøge interfase-celler og ikke påvirkes af celleproliferationstilstanden og er vigtig til at påvise ondartede celler i pleural effusion. Flowcytometri-detekteringsområde: 1. Flowcytometri kan detektere cellestruktur, herunder cellestørrelse, cellestørrelse, celleoverfladeareal, nukleoplasmatisk forhold, DNA-indhold og cellecyklus, RNA-indhold, proteinindhold. 2. Flowcytometri kan detektere cellulære funktioner, herunder celleoverflade / cytoplasmatiske / nukleare specifikke antigener, cellulære aktiviteter, intracellulære cytokiner, enzymaktiviteter, hormonbindingssteder og cellulære receptorer. Grundlæggende information Specialistklassificering: kardiovaskulær undersøgelse: blodundersøgelse Gældende køn: om mænd og kvinder anvender faste: ikke faste Tip: Hold et normalt tankesæt. Normal værdi Kroppen er i en dynamisk balance uden sygdom. Klinisk betydning Klinisk anvendelse af flowcytometri: 1. Anvendelse af flowcytometri i onkologi Flowcytometri kan påvise tumorcelleproliferationscyklus, detektere tumorcelleoverflademarkører, oncogenekspressionsprodukter, gennemføre multidrug-resistensanalyse og opdage apoptose; 2. Anvendelse af flowcytometri i hæmatologi til påvisning af leukæmi og lymfomceller, aktiverede blodplader, tællinger af hæmatopoietisk stamcelle (CD34 +), immunofenotype af leukæmier og lymfomer, tællinger af reticulocyt, tværpasning af celletransplantation og Immunstatusovervågning; 3. Flowcytometri i immunologi kan anvendes til lymfocyt og dets undergruppeanalyse, lymfocytimmunofenotype, påvisning af cytokiner. Unormale resultater Der var data om flowcytometri-analyse af 71 tilfælde af pleural effusion.Resultaterne viste, at følsomheden for malign pleural effusion var 52% og specificiteten var 100%. Hvis den anvendes sammen med rutinemæssig test, kan diagnosens følsomhed være så høj som 94%. DNA-analyse af kræftede pleurale effusionsceller viste en stigning i andelen af ​​aneuploid- og S-fase, G2 / M-fase celler. Mennesker, der skal undersøges, mistænkes for at have kræftformet pleural effusion og andre relaterede sygdomme. Forholdsregler Flowcytometri er ikke et fuldt automatiseret instrument Nøjagtige eksperimentelle resultater kræver nøjagtige manuelle teknikker. Derfor kræver præparatprøve specifikation, og selve instrumentet kræver kvalitetskontrol. (1) Påvirkningsfaktorer og kvalitetskontrol af flowcytometri-immunologisk detektion Flowcytometri har en lang række anvendelser inden for immunologi. Fremstillingen af ​​immunofluorescerende farvningseksempler er meget vigtig, ofte på grund af forekomsten af ​​antropogen ikke-specifik fluorescensinterferens (især ved indirekte immunofluorescensfarvning) eller lav cellekoncentration under prøvefremstilling. Testresultater. Løsningerne på disse påvirkningsfaktorer er som følger: (1) Sørg for, at koncentrationen af ​​prøven, inden maskinen detekteres, er 1X106 celler / ml, og cellekoncentrationen er for lav, hvilket direkte påvirker detekteringsresultatet. (2) Anvendelse af proteinblokerende midler til at blokere ikke-specifikke bindingssteder er især nødvendigt til indirekte immunofluorescensmærkning. Almindeligt anvendte proteinblokerende midler er 0,5% bovint serumalbumin og 1% føtalt bovint serum. (3) Fluorescerende antistof vaskes grundigt efter farvning, vær opmærksom på blandings- og centrifugeringshastighed og reducer overlappende celler og celleaffald. (4) En kontrolprøve blev opsat under anvendelse af en baggrundskontrol af ikke-relateret kontrol og fluorescerende antistoffer, der matchede den samme kilde til antistof. (5) Ved bedømmelse af resultatet bør der tages hensyn til at trække baggrundsfluorescens i. For at gøre den kvantitative analyse af immunfluorescens mere nøjagtig, bruges computerprogrammet til at subtrahere kurvtoppen i kontrolgruppen fra kurvetoppen i den eksperimentelle gruppe ved hjælp af passende kurvemetode. Der kan opnås mere nøjagtige kvantitative immunofluorescensresultater. (6) Vær opmærksom på at undgå lys efter farvning for at sikre stabiliteten af ​​cellulær immunfluorescens. (2) Der er stadig ingen ensartet standard for kvalitetskontrol af DNA-ploidy-analyse. De eksperimentelle resultater, der er rapporteret i forskellige litteraturer, er ret forskellige. I oktober 1993 udviklede den amerikanske kræftforskningsorganisation en samlet standard til bestemmelse af FCM-DNA, som vi kombinerede i henhold til disse standarder. Erfarne eksperter har i mange år øvet på at forklare kvalitetskontrol og forholdsregler ved FCM's DNA-analyseteknologi. (1) Når der tages friske prøver til kirurgisk resektion eller biopsi-nåle, bør det hæmoragiske nekrotiske væv undgås. (2) Prøver skal fikseres eller kryokonserveres i tid efter indsamling for at undgå autolyse og DNA-nedbrydning, hvilket resulterer i fejl i testresultater. (3) Fixativet skal indtage en koncentration, der er meget penetrerende til vævscellerne, og 70% af ethanolen er bedre. (4) Under fremstillingen af ​​enkeltcellesuspension skal du sørge for at adskille komponenterne i cellerne, der skal testes, mindske interferensen af ​​andre komponenter, og sørg for ikke at beskadige cellerne. (5) Indsamling af celleprøver skal sikre tilstrækkelig cellekoncentration, dvs. 1 × 106 celler / ml, urenheder, affald, klumper og overlappende celler bør være <2%, og mindst 20% af prøverne af tumorcelle-DNA-aneuploider bør analyseres. Tumorceller er til stede. (6) Ved fremstilling af den enkelte celle af paraffinindlejret væv skal man være opmærksom på udvælgelsen af ​​vævet uden autolyse og nekrose. For tumorvævsprøven vælges området, der indeholder tumorcellerne; tykkelsen af ​​paraffinvævspladen skal være passende, fortrinsvis 40 til 50 um. Ekstremt tynde eller for tykke skiver vil påvirke testresultaterne; grundigt afvokset for at forhindre, at resterende paraffin påvirker enzymets fordøjelsesaktivitet. Kontroller, at afvoksningen er fuldstændig ved at kaste xylen og tilsætte 100% ethanol. Flydende, hvilket indikerer, at voksen er fjernet; hydrering er tilstrækkelig til at gendanne vævet til en tilstand, der ligner frisk væv; vær opmærksom på fordøjelsestiden og aktiviteten af ​​fordøjelsesenzymer. 0,5% pepsin blev anvendt rutinemæssigt, pH 1,5. (3) Operationelle aspekter (1) Flowcytometeret er i en optimal tilstand under hele arbejdsprocessen, hvilket kan sikre nøjagtigheden og nøjagtigheden af ​​kvantitativ detektion. Ved hjælp af standardprøven til at justere instrumentets variationskoefficient til minimumsområdet er opløsningen i den bedste tilstand for at undgå detektionsfejl forårsaget af ændringer i instrumentforholdene under måleprocessen. (2) Det vigtige indeks til vurdering af instrumentets nøjagtighed er instrumentets variationskoefficient (CV). For kalibreringsprøven, jo mindre CV-værdien er, desto mindre er CV-værdien, hvilket indikerer, at nøjagtigheden af ​​instrumentkalibreringen er højere. Kalibreringsprøver inkluderer ikke-biologiske prøver (fluorescerende mikrosfærer) og biologiske celleprøver (humane lymfocytter, kyllingrøde blodlegemer osv.). På nuværende tidspunkt har ikke-bioluminescerende mikrosfærer kommercielle reagenser, og CV er generelt <2% til 3%. (4) Dataanalyse (1) Når der er for mange affald eller agglomerater i prøven, er antallet af celler, der er målt, under 20%, og histogrammets basislinje bør opgives. (2) Ved udførelse af cellecyklusanalyse skal antallet af prøveceller være 10.000 ekskl. Snavs, urenheder og agglomerater. Når antallet af aneuploidceller tegner sig for mindre end 10% af det samlede antal celler, er det nødvendigt at kombinere andre diagnostiske indikatorer. Som konklusion udgør mindst aneuploide celler mere end 20% af det samlede antal celler, og tilstedeværelsen af ​​aneuploider kan bestemmes. (3) I DNA-analysen blev analysen opgivet, når CV-værdien af ​​den normale diploidcellegruppe var> 8%, men CV-værdien af ​​tumorcellerne var> 8%, hvilket var relateret til tumorcellens heterogenitet. Derudover vil 10% af individerne i det homologe væv i DNA-ploidy-analyse drifte. (4) Kvalitetskontrol af DNA-ploidy-standarder ved anvendelse af det samme individuelle homologe normale væv, den samme fikseringsmetode, den samme prøvebearbejdningsmetode, den samme farvningsmetode, samtidig farvning, de samme instrumentdetekteringsbetingelser, normalt diploidvæv som Intern standard. Inspektionsproces Flowcytometri-analyse: celler i pleuralvæske blev direkte farvet med fluorescerende farvestoffer (såsom propidiumiodid), og DNA-indhold, cellecyklusfordeling og DNA-ploidi af pleuravæskeceller blev analyseret ved hjælp af flowcytometri. Prøveforberedelse til rutinemæssig test ved flowcytometri: (1) Direkte immunofluorescensmærkning Tag en bestemt mængde celler (ca. 1X106 celler / ml), tilsæt direkte det fluorescein-konjugerede antistof til immunmærkningsreaktion (såsom dobbeltmærket eller multimærket farvning, tilføj flere antistoffer mærket med forskellige fluorescein på samme tid), inkuber Efter 20 til 60 minutter vaskes med PBS (pH 7,2 til 7,4) i 1 eller 2 gange, resuspenderes i puffer og test på maskinen. Metoden har fordelene ved enkel betjening, nøjagtigt resultat og nem analyse og er egnet til samtidig bestemmelse af flere parametre i den samme cellegruppe. Selvom omkostningerne ved det direkte mærkede antistofreagens er høje, reducerer det interferensen af ​​stærk ikke-specifik fluorescens i den indirekte mærkningsmetode og er således mere egnet til påvisning af kliniske prøver. (to) indirekte immunofluorescensmærkning Tag en bestemt mængde cellesuspension (ca. 1X106 celler / ml), tilsæt først et specifikt første antistof, vask det ubundne antistof, efter at reaktionen er afsluttet, og tilsæt derefter et fluorescerende mærket sekundært antistof til dannelse af et antigen-antistof-antistofkompleks FCM detekterer den fluorescens, der udsendes af det mærkede fluorescein, efter at det er ophidset. Metoden er lav til omkostninger, og det sekundære antistof bruges i vid udstrækning og bruges mest til detektion af videnskabelige prøver. Da det sekundære antistof generelt er et polyklonalt antistof, er specificiteten imidlertid dårlig, og den ikke-specifikke fluorescerende baggrund er stærk, hvilket let påvirker de eksperimentelle resultater. Derfor bør der tilsættes en negativ eller positiv kontrol til fremstillingen af ​​prøven. Desuden øges tabet af celler på grund af det store antal trin i standardmærkningsmetoden, og det er ikke egnet til at måle prøver med et lille antal celler. Ikke egnet til mængden Ingen.